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地衣酚显色法测定KoleosNA含量实验原理和措施,核

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核心提示:原理 核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯反应呈鲜绿色,该反应需

核心提示:一、目的: 了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。 二、原理: RNA含量测定,除可用紫外吸收法及定磷法外,常用一、目的: 了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。 二、原理: RNA含量测定,除可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定。其反应原理是:当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe 3+或Cu 2+催化下,生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20—250μg·ml-1范围内,光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此,测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。 三、器材与试剂: 1.器材: ①分析天平。 ②沸水浴锅。 ③试管。 ④吸量管。 ⑤分光光度计。 2.试剂 ①RNA标准溶液(须经定磷确定其纯度):取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。 ②样品待测液:配成每毫升溶液含RNA干燥制品50—100微克。 ③地衣酚试剂:先配0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。 四、操作步骤: 1.标准曲线的制作 取12支干净烘干试管,按下表编号及加入试剂。平等作两份。加毕置沸水浴加热25min,取出冷却,以零号管作对照,于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线。2.样品的测定 取两支试管,各加入2.0ml样品液,再加2.0ml地衣酚-Cu 2+试剂。如前述进行测定。 五、结果与讨论: 1.绘制出标准曲线 2.RNA含量的计算 根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量,按下式计算出制品中RNA的百分含量:注意事项 样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。 本法特异性较差,凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰,甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应,产生显色复合物。此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收。阅读全文

原理 核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂,反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20~250μg范围内,光吸收与RNA的浓度成正比。地衣酚反应特异性较差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA含量,再计算出RNA含量。

操作方法 一、RNA标准曲线的制定 取10支试管,分成2组,依次加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mLRNA标准溶液。分别加入蒸馏水使最终体积为2.5mL。另取2支试管,各加入2.5mL水作为对照。然后各加入2.5mL地衣酚试剂。混匀后,于沸水浴内加热20分钟。取出冷却。于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标作图,绘制标准曲线。

二、制品的测定 取2支试管,各加入2.5mL待测液,(样品量应在标准曲线的可测范围之内),再加2.5mL地衣酚试剂。如前所述进行测定。

三、RNA含量的计算 根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收值的RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量:

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